本试剂盒采用双抗体夹心法。用抗鱼 p-AKT 抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的鱼 p-AKT 会与包被抗体结合，再加入辣根过氧化物酶标记的抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反应洗板后，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB 在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在 450nm 波长处测OD 值，鱼 p-AKT 浓度与OD450 值之间呈正比， 通过绘制标准曲线计算出样品中鱼p-AKT 的浓度。

试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在 2-8℃保存 6 个月；拆封后建议在 1 个月内使用。

说明：

1、标准品浓度从高到高依次为：16、8、4、2、1、0.5 μmol/L。

2、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。试剂体积以实际发货为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取，而非直

接倒出。

试验所需自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水样品收集方法:

样品种类繁多，建议使用参考论文中的样本处理方法，以下罗列常规几种样品制备方法，仅供参考。

1. 血清：全血样品于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 2000prm 转速离心 20 分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。

2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA 钠盐，样品采集后 30 分钟内于 2000prm 转速离心 15 分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3. 组织匀浆：用预冷的 PBS(0.01M，pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按 1: 9 的重量体积比， 比如 1g 的组织样品对应 9mL 的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在 PBS 中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液 5000prm 转速离心 5-10 分钟，取上清检测。

4. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的 PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化， 2000prm 转速离心 5 分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的 PBS 洗涤 3 次。每 1×106 个细胞中加入 150-200μL PBS 重悬，反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS 的体积)。将提取液于 2000prm 转速离心 10

分钟，取上清检测。

5. 细胞培养上清或其他生物体液：2000prm 转速离心 20 分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

样品注意事项:

1. 样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃以下，避免反复冻融。标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

2. 试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)。

3. 若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致 ELISA 测值出现偏差。

4. 某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

检测前准备工作：

1. 试剂盒及样本从冰箱中取出后应置室温(25-28ºC)平衡 120 分钟（注意：

试剂盒和样本的平衡，非常重要，一定要平衡到足够时间）；每次检测后剩余试剂请及时置于 4ºC 保存。

2. 配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至 1X， 例如 10ml 洗涤液(20X)加 190ml 水混匀后即为 1X 的洗涤液。

操作步骤：

1. 计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在 96 孔

框架内，剩余微孔板放回铝箔袋密封，保存于 4ºC。

2. 试剂盒和样本在室温下(25-28ºC)平衡 120min，充分平衡到室温（注意：

试剂盒和样本的平衡，非常重要，一定要平衡到足够时间）。

3. 设置标准品孔、样本孔和空白孔。

4. 标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；

5. 样本孔中加入待测样本 50μL；

6. 空白孔加入样本稀释液 50μL；

7. 所有孔中，每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体 100μL， 用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。

8. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置 20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。

9. 每孔加入底物A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

10. 每孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的OD 值。结果分析：

1. 复孔的值通常在 15 的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。

2. 每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。

3. 绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450 值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线（直线拟合）计算出样品的相应浓度（工作人员可提供计算软件）。

4. 若样品 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时