本试剂盒采用双抗体夹心法。用抗人Gas抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人Gas会与包被抗体结合，再加入辣根过氧化物酶标记的抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，反应洗板后，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，人Gas浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中人Gas的浓度。  

试剂盒组成及保存 

未拆封的试剂盒可在2-8℃保存6个月；拆封后建议在1个月内使用。

组份	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
标准品	0.3mL*6管	0.3mL*6管	无
稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	30mL	30mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

 

 

 

 

 

 

 

 

 

说明：

1、标准品浓度从高到高依次为：320、160、80、40、20、10 pg/mL。

2、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。试剂体积以实际发货为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取，而非直接倒出。

试验所需自备物品

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样品收集方法: 

样品种类繁多，建议使用参考论文中的样本处理方法，以下罗列常规几种样品制备方法，仅供参考。

1. 血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于2000prm转速离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。

2. 血浆：抗凝剂推荐使用EDTA钠盐，样品采集后30分钟内于2000prm转速离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M，pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000prm转速离心5-10分钟，取上清检测。

4. 细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，2000prm转速离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×10⁶个细胞中加入150-200μL PBS重悬，反复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于2000prm转速离心10分钟，取上清检测。

5. 细胞培养上清或其他生物体液：2000prm转速离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

样品注意事项:

    1. 样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃以下，避免反复冻融。标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

2. 试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议查阅文献后先做预实验，以确定稀释倍数)。

3. 若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。 

4. 某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

检测前准备工作：

1. 试剂盒及样本从冰箱中取出后应置室温(25-28ºC)平衡120分钟（注意：试剂盒和样本的平衡，非常重要，一定要平衡到足够时间）；每次检测后剩余试剂请及时置于4ºC保存。

2. 配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。  

操作步骤：

1. 计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，剩余微孔板放回铝箔袋密封，保存于4ºC。

2.  试剂盒和样本在室温下(25-28ºC)平衡120min，充分平衡到室温（注意：试剂盒和样本的平衡，非常重要，一定要平衡到足够时间）。

3.  设置标准品孔、样本孔和空白孔。

4.  标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

5.  样本孔中加入待测样本50μL；

6.  空白孔加入样本稀释液50μL；

7.  所有孔中，每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

8.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

9.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

10. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果分析：

1. 复孔的值通常在15%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。

2. 每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。

3. 绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线（直线拟合）计算出样品的相应浓度（工作人员可提供计算软件）。

4. 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。

 

（示意图，仅供参考）

注意事项： 

1. 加样时，请注意每个样品或标准品必须更换枪头，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取体积的误差。 

2. 不能混用不同批号的试剂盒组份，每批试剂盒都经过独立测试。

3. 试剂盒很多操作在室温进行，要求严格控制室温在22-28ºC。温度低于22ºC会导致最终检测到的吸光度显著下降。

4. 洗涤过程非常重要，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。